生物堿的分離方法的確很多，既有經(jīng)典的分離方法，如溶劑萃取法、蒸餾法、沉淀法、鹽析法、結晶法、膜滲透升華法等，也有較為現代、先進(jìn)的分離方法，如色譜分離法。
1.硅膠柱色譜分離法
硅膠柱色譜分離法主要利用二氧化硅作為填料，是較為常用的柱色譜分離方法。硅膠為中性無(wú)色顆粒，其性能穩定。硅膠層析柱適用范圍廣，既能用于非極性生物堿也能用于極性生物堿，且成本低，操作方便，是常見(jiàn)的生物堿的分離方法。
2.氧化鋁柱色譜分離法
氧化鋁柱色譜分離法是以氧化鋁作為填料的層析分離法，適合于酸性大、活化溫度較高的生物堿的分離。比如采用氧化鋁層析方法正向分離非酚性粉防己堿與粉防己若林堿，其Rf值適中，展開(kāi)后放置10min以顯色劑噴濕潤效果為最好、且穩定，可得到較好的效果。這種柱色譜分離法也是較為常用的生物堿分離的方法之一。這是由于許多生物堿極性較小，氧化鋁對它們吸附較小，而雜質(zhì)常被吸附。
3.離子交換樹(shù)脂分離法
離子交換樹(shù)脂對吸附質(zhì)的作用主要是通過(guò)靜電引力和范德華力達到分離純化化合物的目的。隨著(zhù)人們對生物堿的認識和了解，離子交換樹(shù)脂已應用于生物堿的分離提取中。離子交換技術(shù)有設備簡(jiǎn)單、操作方便、生產(chǎn)周期短、能源消耗少、成本低、產(chǎn)品純度高、不吸潮、不加輔料就可以成型等特點(diǎn)。而傳統的水煮法和水醇法提取分離得到的制劑總是又黑、又大、又粗，使用極不方便;有機溶劑萃取方法，溶劑用量大，環(huán)境污染嚴重。因而離子交換樹(shù)脂法在生物堿的提取、分離的研究與生產(chǎn)中應用日益廣泛。
4.高速逆流色譜分離法
高速逆流色譜分離法(high speed coutercurrent chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)HSCCC)是一種新的分離技術(shù)，它對生物堿的分離和制備具有很大的優(yōu)勢，特別是對進(jìn)樣量較大的樣品具有獨特的優(yōu)點(diǎn)，其應用前景越來(lái)越引人注目。
經(jīng)過(guò)前期對多糖的提取，去除蛋白質(zhì)、色素、小分子等物質(zhì)得到粗多糖，而這些粗多糖其實(shí)是由很多分子量、結構不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖，仍需進(jìn)一步對這些粗多糖進(jìn)行分離純化。
1、分步沉淀法
多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來(lái)。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進(jìn)一步純化，方可得到均一性的多糖。
2、柱層析法
要獲得均一性的多糖，一般是先經(jīng)過(guò)陰離子交換柱進(jìn)行粗步純化，然后再用凝膠柱進(jìn)一步純化。有些多糖也采用大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行純化。下面對這三種柱層析法進(jìn)行詳細介紹。
3、陰離子交換法
一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類(lèi)和高等植物的多糖進(jìn)行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質(zhì)有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類(lèi)、玉米等植物、桑黃等藻類(lèi)粗多糖進(jìn)行分離純化。使用DEAE-52填料進(jìn)行多糖的初步分離純化，該柱子一般直徑偏大，其中以2.6cm最多，操作過(guò)程中流動(dòng)相的流速也較快，流速一般在0.7-2ml/min之間，以1ml/min最多，至于柱子的長(cháng)度，選擇范圍較廣，從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類(lèi)、植物和藻類(lèi)粗多糖的初步分離純化中，在選擇層析柱的直徑、流速和長(cháng)度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動(dòng)相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。
4、凝膠色譜法
凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關(guān)系實(shí)現分離，類(lèi)似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG）、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝膠ToyopearlHW等。多糖的進(jìn)一步分離往往會(huì )選擇用各種凝膠進(jìn)行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進(jìn)行純化的標準是多糖的分子量，不同種類(lèi)和型號的凝膠能夠分離多糖類(lèi)型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規格常具有長(cháng)而細的特點(diǎn)，直徑以1.6cm偏多。無(wú)論什么類(lèi)型的凝膠柱，流動(dòng)相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。
一、黃酮提取
（一）溶劑萃取法：
黃酮苷和極性較大的苷元：甲醇，乙醇，甲醇-水（1：1），丙酮，乙酸乙酯。
多糖苷：沸水
花色苷：0.1%鹽酸進(jìn)行提取。
苷元：氯仿，乙醚，乙酸乙酯。
注意：苷類(lèi)提取防止酶解。
（二）堿提酸沉法
常用堿水：石灰水，Na2CO3，稀NaOH，堿性稀醇。
酸沉：鹽酸
注意：酸堿濃度不宜過(guò)高。
（三）炭粉吸附法：適于苷類(lèi)的精制。大部分可被7%酚-水洗下。
二、分離方法
分離的基本依據：
極性差異、酸性強弱、分子大小和特殊結構。
（一）柱色譜法
1、硅膠柱色譜法
適于分離異黃酮，二氫黃酮（醇）和高度甲基化或乙?；狞S酮及黃酮醇類(lèi)。
分離苷元時(shí)：氯仿-甲醇混合溶劑洗脫。
分離苷時(shí)：氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水
2、聚酰胺柱色譜
規律：
A：苷元相同時(shí)，以含水移動(dòng)相洗脫，被吸附的強弱順序為： 苷元>單糖苷>雙糖苷>雙糖鍵苷。
B：與酚羥基的數目有關(guān)，數目越多，吸附力越強。與酚羥基的位置有關(guān)，如果酚羥基所處的位置易形成分子內氫鍵，則吸附力減弱。
C：不同類(lèi)型黃酮類(lèi)化合物，被吸附的強弱順序為：黃酮醇>黃酮>二氫黃酮>異黃酮。
D：分子內芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，則吸附力越強。
查耳酮>二氫黃酮， 黃酮>二氫黃酮
3、葡聚糖凝膠色譜法
凝膠類(lèi)型：Ssephadex LH-20和Sephadex G兩種類(lèi)型的凝膠。分離苷元時(shí)：利用吸附作用，游離酚羥基數目越多，則吸附力越強，越難洗脫。分離苷時(shí)：主要靠分子篩，洗脫時(shí)按苷分子量由大到小的順序依次被洗脫出柱體。
黃酮類(lèi)化合物 取代基 Ve/Vo
芹菜素 5，7，4‘-三羥基 5.3
木犀草素 5，7，3‘，4’-四羥基 6.3
槲皮素 3，5，7，3'，4'-五羥基 8.3
楊梅素 3，5，7，3‘，4’，5‘-六羥基 9.2
山柰酚-3-鼠李糖基 三糖苷 3.3
半乳糖-7-鼠李糖苷
槲皮素-3-蕓香糖苷 雙糖苷 4.0
槲皮素-3-鼠李糖苷 單糖苷 4.9
常用的洗脫劑：堿性水溶液，含鹽水溶液、醇及含水醇
（二）PH梯度法：用不同濃度的堿分離
（三）硼酸絡(luò )合法 具有鄰二酚羥基的黃酮類(lèi)化合物可與硼酸絡(luò )合生成易溶于 水的化合物
